T7 Transcription Kit说明书

【产品编号】

JT101-01

【产品说明】

本试剂盒进行了体外转录体系的优化，利用T7 RNA Polymerase，以含有T7启动子的超螺旋质粒DNA或线性DNA 为模板，对T7启动子下游的DNA序列进行高效转录。本产品适用于制备长度超过6000 nt的高浓度RNA，使用1μg DNA模板可在20μl体系生成150~280μg的RNA(如果想获得毫克级的RNA产物，可平行放大反应体系)。制备的RNA可用于体外翻译、RNase保护实验、RNA剪切以及杂交探针标记等。

【保存条件】

-20℃，保存一年

【试剂盒组成】

【模板参考】

T7 Promoter：5'-TAATACGACTCACTATAGGG^#-3'#:G/A

Terminator：5'TTCCATCTGTTTTCTTATCTGTTCTTTCATCTGTTCTTTTATCTGTTTGTTT 3'

【操作流程】

1、除了T7 Enzyme Mix之外，将其余组分短暂离心并收集于管底。

2、配制转录反应：

*注意：提前计算好体系，然后严格按照以下顺序加入各反应组分：水→Buffer→NTP→DNA模板→酶。

3､移液枪轻轻混匀各组分并短暂离心收集于管底，37℃孵育2小时。

*注意：为避免长时间转录导致反应液挥发，建议在PCR仪中进行反应并将热盖温度设置为65℃。模板量及孵育时间可适当调整。

4､消化DNA模板：反应结束后,加入2μl DNase I，37℃反应30分钟；结束后加入1μl 500 mM EDTA(pH 8.0)终止反应(加入EDTA后应立即进行后续纯化)，或者消化完成后不加入EDTA,直接进入纯化步骤｡

5､产物纯化

6､转录产物定量､检测：

(1)通过紫外分光光度计测定RNA浓度，产物浓度极高,建议稀释后再测｡

(2)100~1000 nt的RNA产物推荐使用6%丙烯酰胺、7M尿素变性胶检测,电泳缓冲液为1×TBE Buffer｡

l 10×TBE Buffer：0.9 M Tris Base、0.9 M Boric Acid､20mM EDTA。

l 凝胶配制方法：每10ml中，尿素4.2g,RNase-free Water 4.4ml，40%(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=19:1)丙烯酰胺1.5ml，10×TBE Buffer 1ml,10%AP 100μl，TEMED 10μl。AP和TEMED在尿素完全溶解后加入。

(3)500~6000 nt的RNA产物推荐用1%甲醛琼脂糖变性胶检测,电泳缓冲液为1×MOPS Buffer｡

l 10×MOPS Buffer：0.4 M MOPS(pH 7.0)､0.1 M Sodium Acetate､10mM EDTA｡

l 凝胶配制方法：每100ml中,称量1g琼脂糖加入72ml RNase-free Water中，加热溶化后，加入10ml 10×MOPS Buffer。待溶液冷却至50~60℃时，加入18ml甲醛(37%)，混匀，倒胶。

(4)电泳检测时，取0.2~1 μg RNA，用RNase-free Water稀释至5μl，加入等体积的2×RNA Loading Buffer混匀，70℃孵育10分钟后冰浴2分钟，全部点样。电泳结束后用Gelstain或EB染色观察，RNA Marker与RNA样品处理方法相同(或参考供应商使用说明书)。

【数据参考】

图1 20μl体系下，长度小于300nt的RNA转录产量与模板投入量、转录时间的关系图